液相色譜儀流動(dòng)相的選用要求
　　液相色譜儀流動(dòng)相的選用要求包括流動(dòng)相性質(zhì)要求、流動(dòng)相選擇、流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相脫氣、流動(dòng)相過(guò)濾、流動(dòng)相貯存、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題和HPLC用水等方面。
　　一、流動(dòng)相性質(zhì)要求：
　　HPLC中，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k值減?。惠^弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附增加，相應(yīng)的容量因子k值增大。因此，k值是流動(dòng)相組成的函數(shù)。理論塔板數(shù)一般與流動(dòng)相的粘度成反比。
　　1、流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：
　　低交聯(lián)度的離子交換樹(shù)脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。
　　堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。
　　酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁和氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
　　2、純度高：
　　色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
　　3、必須與檢測(cè)器匹配：
　　當(dāng)使用UVD時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收或吸收很小。
　　當(dāng)使用RID時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。
　　4、粘度低：
　　高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散和傳質(zhì)，使柱效降低，還會(huì)使柱壓增加，分離時(shí)間延長(zhǎng)。選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
　　5、對(duì)樣品的溶解度要適宜：
　　如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在色譜柱內(nèi)沉淀，不但影響純化分離，而且會(huì)使色譜柱惡化。
　　6、樣品易于回收：
　　應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
　　二、流動(dòng)相選擇：
　　HPLC中，溶劑的洗脫能力與溶劑極性相關(guān)。
　　1、正相色譜的流動(dòng)相：
　　在正相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加。
　　正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。
　　2、反相色譜的流動(dòng)相：
　　在反相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。
　　反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑（如甲醇、乙腈和四氫呋喃等）。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及所占比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇－水系統(tǒng)滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小，價(jià)格低，是反相色譜zui常用的流動(dòng)相。
　　乙腈－水系統(tǒng)與甲醇－水系統(tǒng)相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，可滿足在紫外185～205nm處檢測(cè)的要求，綜合來(lái)看，乙腈－水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇－水系統(tǒng)。
　　在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，需采用梯度洗脫。
　　三、流動(dòng)相pH值：
　　采用反相色譜分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，以抑制樣品組分的解離、增加組分在固定相上的保留和改善峰形的技術(shù)，稱為反相離子抑制。
　　1、弱酸樣品：
　　對(duì)于弱酸樣品，流動(dòng)相pH值越小，組分k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在。
　　分離弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液。
　　2、弱堿樣品：
　　對(duì)于弱堿樣品，情況與弱酸樣品相反。
　　分離弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
　　流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象，在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）稱為減尾劑或除尾劑。
　　四、流動(dòng)相脫氣：
　　1、流動(dòng)相脫氣的原因：
　　HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵工作、柱分離效率、檢測(cè)器靈敏度和基線穩(wěn)定性，甚至無(wú)法檢測(cè)。
　?。?）流動(dòng)相中的溶解氧可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。
　?。?）溶解氧會(huì)引起溶劑pH變化，給分析結(jié)果帶來(lái)誤差。
　　（3）溶解氧能與某些溶劑（如甲醇和四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度輕微降低，更重要的是在梯度洗脫時(shí)會(huì)造成基線漂移或形成鬼峰。除去溶解氧將大大提高UVD的性能。
　　（4）在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛和酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。除去溶解氧將改善在一些熒光檢測(cè)中的靈敏度。
　?。?）在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），溶解氧的影響更大。
　　2、常用脫氣方法：
　　有吹氦脫氣法、加熱回留法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法和在線真空脫氣法等。
　　五、流動(dòng)相過(guò)濾：
　　所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm或0.22μm濾膜過(guò)濾，以除去雜質(zhì)微粒。色譜純?cè)噭┮膊焕?，除非在?biāo)簽上標(biāo)明已過(guò)濾。
　　用濾膜過(guò)濾時(shí)，要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。
　　有機(jī)相濾膜一般用于過(guò)濾有機(jī)溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速低或過(guò)濾不動(dòng)。
　　水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑。否則濾膜會(huì)被溶解，溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。
　　對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別過(guò)濾。如需混合后過(guò)濾，有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)已有混合型濾膜。
　　六、流動(dòng)相貯存：
　　流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因?yàn)樵S多有機(jī)溶劑（如甲醇和乙酸等）可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑被污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。
　　磷酸鹽和乙酸鹽緩沖液很容易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新過(guò)濾。
　　容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的容器，以除去容器底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的容器無(wú)此現(xiàn)象。
　　七、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題：
　　1、鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。
　　2、鹵代溶劑與水的混合物比較容易反應(yīng)，不能存放太久。
　　3、鹵代溶劑（如CCl4和CHCl3）等與各種醚類（如二異丙醚和四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用或新鮮配制。
　　4、鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。
　　總之，鹵代溶劑新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問(wèn)題。
　　八、HPLC用水：
　　HPLC應(yīng)用中要求用超純水，如檢測(cè)器基線的校正和反相柱的洗脫。